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I titoli di testa illustrano brevemente quanto accaduto in Spider-Man e Spider-Man 2 attraverso l'utilizzo di alcune scene dei primi due film, incastonate tra le trame di una ragnatela nera e misteriosa.
Peter Parker (Tobey Maguire) sta vivendo forse il periodo più felice della sua vita: è finalmente riuscito a trovare un equilibrio tra l'amore che prova per Mary Jane Watson (Kirsten Dunst) e i suoi doveri da supereroe, e questo giova a tutte le sue attività. È infatti il primo del corso di fisica del professor Connors e il lavoro di fotografo free-lance per il Daily Bugle gli va a gonfie vele. Anche la carriera di Mary Jane sembra procedere bene, perché esordisce come protagonista in un musical a Broadway.
Allo spettacolo assiste anche Harry Osborn (James Franco), un tempo amico di Peter che ora però lo odia perché lo ritiene responsabile della morte di suo padre Norman (il Green Goblin). Sapendo che Peter e Spider-Man sono la stessa persona, Harry giura vendetta e dopo lo spettacolo si sottopone al gas in grado di migliorare le sue capacità fisiche (come ha fatto suo padre Goblin), diventando New Goblin. Ma mentre Peter e Mary Jane osservano romanticamente le stelle, un meteorite cade poco lontano e da questo esce una strana sostanza nera che si attacca al motorino di Peter, seguendolo fino a casa.
Soddisfatto di come stanno andando le cose, Peter decide di chiedere a Mary Jane di sposarlo, ma subito dopo essersi fatto dare la fede da zia May viene attaccato da Harry a bordo di uno skateboard volante e con un'armatura in qualche modo simile a quella di suo padre. Alla fine di una lotta molto acrobatica, Harry sbatte violentemente la testa perdendo i sensi e la memoria. Una volta uscito dall'ospedale, infatti, non ricorda più che Spider-Man è in realtà Peter Parker né che lo pensa responsabile della morte di suo padre.