Sono passati due anni e Larry Dailey (Ben Stiller) ha lasciato il museo di Storia Naturale, dove lavorava come guardiano notturno, ed è entrato nel mondo degli affari, diventando un importante imprenditore. Un giorno torna al museo spinto dai ricordi e scopre che tutti i pezzi saranno sostituiti con degli ologrammi mentre le statue di cera saranno imballate e trasferite nell'archivio federale dello Smithsonian museum. Gli unici pezzi a non lasciare il museo saranno la statua di Teddy Roosevelt (Robin Williams) e la tavola d'oro del faraone Akmen-ra.
Una sera, Larry riceve la telefonata di Jebediah (Owen Wilson), il piccolo cowboy, che gli dice di essere stato spostato nello Smithsonian dove vengono tenuti in ostaggio dal perfido fratello maggiore di Akmen-ra, Kah Mun Ra (Hank Azaria). Tutto ciò è successo perché la notte prima del trasferimento, la piccola scimmia cappuccina Dexter aveva rubato la tavola di Ackmen-ra e di conseguenza se l'era portata dietro durante lo spostamento allo Smithsonian: quindi ora tutto il museo più grande del mondo ha preso vita.
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